Руководство по эксплуатации стенд регулировки фар

Руководство по эксплуатации стенд регулировки фар

1. Важнейшие указания
Руководство по эксплуатации содержит необходимые указания для гарантии корректного использования прибора.

Они являются существенной составной частью прибора и должны тщательно сохраняться. Перепечатка запрещена.

1.1 Общие указания по безопасности

Перед использованием прибора для измерения светораспределения указания данной брошюры должны быть тщательно прочитаны.

Чтобы избежать повреждений прибора, он должен эксплуатироваться специалистами, получившими инструктаж. Использовать только в сухих, светлых и хорошо проветриваемых рабочих помещениях.

При испытании должен быть задействован ручной тормоз проверяемого транспортного средства.

Чтобы избежать неправильных показаний, прибор для измерения светораспределения не должен использоваться при сильном солнечном свете или в помещениях с экстремальными колебаниями температур.

Для использования прибора нет необходимости в источнике тока.

Прибор поставляется в рециркуляционном картоне.

Для возможного демонтажа прибора необходимо соблюдать раздел „Демонтаж и устранение отходов“.

7.1 Ассиметричные фары

Идеальная картина на панели для ассиметричных фар с

15° подъемом границы светотени

В ассиметричных фарах, справа, непосредственно ниже середины, должна возникать маленькая (в сравнении с остальной проекцией) более сильно освещенная зона.

7.2 Симметричные фары

Идеальная картина на панели для симметричных фар

При проверке симметричных фар, проекция бросает на внутреннюю панель идеальную горизонтальную линию без углов.

Внимание: Противотуманные фары могут быть как симметричными, так и ассиметричными.

7.3 Фары ближнего света, имеющие общую конструкцию с фарами дальнего света
(Фары с двумя лампами, отражатели которых настраиваются не по отдельности или фары с лампой с двойной нитью накала)

Должны быть принципиально установлены на ближний свет в соответствии с 7.1 или 7.2. Корректировка положения дальнего света должна осуществляться только тогда, когда точка излома ближнего света остается в пределах допустимого допуска.

7.4 Отдельный дальний свет

Идеальная картина на панели для независимых фар дальнего света

В фарах, сконструированных только для дальнего света, наибольшая сила света расположена в пункте F (центральная метка) панели.

Рис. 7

В большинстве случаев эта линия помогает, но существуют фары с различными формами..

1. Прибор для измерения светораспределения и транспортное средство подготовить в соответствии с предшествующими указаниями.
2. Считать заданное значение изготовителя, указанное вблизи фар или на фабричном щитке. Если таковые отсутствуют, взять значения из таблицы настройки .

L маховичок

Рис. 8

1. Поворотами маховичка L установить заданное значение, при этом на внешней шкале M должны считываться целые %-
   значения, а точная регулировка (промежуточные значения) на шкале маховичка.
2. Включить ближний свет. На внутренней панели возникнет соответствующий световой конус.
3. Повторно проверить, совпадает ли он с линией (смотри рис. 10 или 11)
4. При необходимости выровнять с помощью регулирующей системы фар на транспортном средстве до получения желаемого результата.
5. При проверке ассиметричных фар – наиболее используемых сегодня — (смотри рис. 10)
   необходимо учитывать, что проекция освещает также отрезок правой части панели, поверх горизонтальной линии, обычно под углом в 15°.

2. Конструкция прибора

1. ПЛИТА ОСНОВАНИЯ
2. КОЛОННА
3. ПЕРЕМЕЩАЮЩИЙ МЕХАНИЗМ
4. ЗЕРКАЛЬНЫЙ ПРИЦЕЛ

G) РУЧКА (опция)
H) КОЛЕСА

L) БОЛТЫ С ШЕСТИГРАННЫМ УГЛУБЛЕНИЕМ

M) КОЖУХ ДЛЯ ЗАЩИТЫ ОТ ПЫЛИ

Прибор поставляется в собранном виде. Монтаж и юстировка выполняются производителем.

Рис. 2
Посредством контроля готового изделия на предприятии гарантируется, что прибор полностью юстирован. Прибор не нуждается в электропитании, так как люксметр работает от фотодиода.

Перед отправкой с предприятия прибор испытан на предмет безупречного функционирования. Сюда относится юстировка ящика оптики на горизонтальную установку, а колонны на вертикальную, абсолютно перпендикулярную установку. Для корректных результатов испытаний необходимо, чтобы измерения осуществлялись в абсолютно параллельном положении прибора относительно транспортного средства.

Прибор оснащен кругообразным уровнем, расположенным на дне фасада корпуса. Он заметен через прозрачную панель при включенном на транспортном средстве свете.

Если замечено, при наблюдении за данным уровнем, что прибор нуждается в юстировке, необходимо обратиться к специалистам продавца. Регулировка блокирована трубчатым разрезным штифтом для гарантии безопасности измерений.

Необходимая калибровка люксметра может быть проведена только сервисным предприятием производителя. С этой целью, прибор для измерения светораспределения высылается поставщикам.

В соответствии с § 50 раздел 8 StVZO для многоколейных транспортных средств (ТС) с первым допуском к эксплуатации с 1 –го января 1990 года, за исключением тягачей и рабочих машин, для фар ближнего света с уровнем не более 1200 мм над проезжей частью, действуют предписания правовой нормы 76/756/EWG. Таким образом, для регулировки фар этих транспортных средств обязателен установочный размер, указанный на данных транспортных средствах, независимо от того, выдано или нет EG- или ECE-одобрение касательно конструкции осветительного устройства. Из таблицы ниже видно, какой установочный размер, для какого транспортного средства является основополагающим.

1. В транспортных средствах A) также B) 1a до 1e таблицы:
   по 5 см. вверх и вниз.
2. В транспортных средствах B) Nr. 1f до 1h также 2 и 3 таблицы:
   10 см. вверх и 5 см. вниз.

Таблица настройки по StVZO

Вид транспортного средства Установочный размер «e» в см. на 10 м

Фары ближнего света Противотуманные

A) Многоколейные ТС с первым допуском с 01/01/1990 — исключение

С/х и лесные тягачи и рабочие машины Установочный размер смотри B)

С фарами, наивысшая точка светящейся плоскости которых на ТС

не выше, чем 1200 мм над проезжей частью:

B) Другие транспортные средства

1. ТС, у которых наивысшая точка светящейся плоскости фар находится

1. Легковые автомобили (также для универсалов) 1,2 2,0
2. Автотранспорт (АТ) с рессорой, регулирующей высоту, или автоматическим выравниванием уровня светового пучка*
3. Многоосные тягачи или рабочие машины 1,0 2,0
4. Одноколейный автотранспорт**
5. Грузовики с горизонтальной погрузочной платформой

*) Особенности данных устройств должны быть учтены по инструкциям производителей.

**) Велосипеды со вспомогательным мотором, с осветительной установкой в 3 Ватта рассматриваются как велосипеды

Проверка фар и – регулировка по StVO

В транспортных средствах, где фары могут регулироваться вручную, для рабочего положения регулирующее устройство должно находиться в предписанном фиксированном положении. Многоколейный автотранспорт в разгруженном состоянии, но с одной персоной или с нагрузкой 75 кг. на водительском сиденье. Одноколейные транспортные средства, а также одноосные тягачи или рабочие машины (с тележками с креслом для оператора или с прицепами) с одной персоной или с нагрузкой в 75 кг на водительском сиденье.

Рис. 6

e = Отклонение границы светотени в см. на удалении 10 метров

H = Высота середины фар над опорной поверхностью в см.

h = Высота разделительной линии измерительного экрана над опорной поверхностью в см.

Для проверки светораспределения необходимо установить отклонение луча фар вниз на расстоянии 10 метров. Смотри на картинке сверху параметр “е”.

В общем, действительно заданное значение изготовителя, указанное вблизи фар или на фабричном щитке.

4. Подготовка транспортного средства по StVZO

1. Проверить давление воздуха в колесах на соответствие данным изготовителя.
2. Многоколейный автотранспорт разгрузить, нос нагрузкой в одну персону или 75 кг на сиденье водителя.
3. Одноколейные транспортные средства или одноосные тягачи или – рабочие машины (с тележками с креслом для оператора или с прицепами) с одной персоной или с нагрузкой в 75 кг на водительском сиденье.
4. Транспортные средства с регулируемым уровнем, например с гидравлической или – воздушной рессорой, должны быть приведены в соответствии с руководством производителя в положение уровня, предусмотренное для нормального движения.
5. В транспортных средствах с автоматической регулировкой угла наклона фар, необходимо учитывать указания производителя.
6. В транспортных средствах, где фары могут регулироваться вручную, для рабочего положения регулирующее устройство должно находиться в предписанном фиксированном положении. В фарах с регулирующим устройством с двумя позициями, в которых фиксированное положение не особенно обозначено, необходимо действовать, как следует ниже:

В транспортных средствах, в которых пучок света при возрастающей нагрузке опускается, настройка должна осуществляться в конечном положении регулирующего устройства, при котором пучок света находится в наиболее низкой позиции.

Необходимо обратить внимание на то, что вес в порожнем состоянии это вес готового к использованию транспортного средства без сменных носителей груза, с полностью заполненными встроенными баками для топлива (минимум 90% в соответствии с § 76 / 756 / EWG, приложение 5), включая вес всех находящихся одновременно в использовании частей оборудования. В других автомобилях, таких как одноколейные транспортные средства с двигателем и легковые автомобили, дополнительно 75 кг. как вес водителя.

Сменные носители груза это емкости, предназначенные для приема груза и применяемые на различных транспортных средствах – носителях, например контейнеры, сменные емкости.

Частями оборудования являются, например: запасные колеса, запасные части, инструмент, подъемник, огнетушитель, насадные стены, каркас для тента с дужками, рейками или стержнями, тент, приспособление противоскольжения, груз.

5. Рабочий процесс

5.1

Подготовка транспортного средства

Фары должны быть чистыми и сухими.

Если ТС оснащено внутри бесступенчатой регулировкой угла наклона фар, она должна быть установлена в позиции «O». Если регулировка имеет две фиксирующие позиции, обратите внимание на главу 4.

Удалить все, что может повлиять на корректную регулировку фар: грязь, снег, лед и т.д.

Рулевой механизм установить прямо.

Необходимо учитывать, что корректная проверка возможна только на абсолютно плоской поверхности (смотри рисунок).

_{M ax 0,5%}

Инструкция по эксплуатации. Устройство для регулировки фар автомобиля. HLT

2 Указания по вводу в эксплуатацию. 1. Общая информация Передвижное устройство для настройки фар автомобиля HLT 600 и HLT Устройство для настройки фар автомобиля на наземных рельсах HLT Устройство для настройки фар автомобиля. 2. Условия для настройки фар автомобиля Место проведение настройки Давление воздуха в шине Автомобильная фара Установка контрольного прибора Выравнивание контрольного прибора по отношению к продольной оси транспортного средства Настройка прибора. 3. Немецкие инструкции по настройке приборов Таблица по настройке прибора. 4. Фотограммы Лобовые фары с асимметрическим ближним светом Лобовые фары с асимметрическим ближним светом и противотуманные фары Лобовые фары с указанием уклона. 5. Люксметр. 6. Техобслуживание и уход.

3 Указания по вводу в эксплуатацию прибора. У установочных устройств HLT 600 и 610 перед их первым вводом в эксплуатацию необходимо установить в рабочую позицию зеркало выравнивания и рукоятку. Для этого следует выполнить следующее: Зеркало выравнивания Ослабьте при помощи ключа с шестигранным углублением 4мм стопорный болт (1), который находиться на опорной стойке прибора. Поверните рукав (2), на котором прикреплено зеркало выравнивания, на 180º вверх. Закрутите вновь стопорный болт. Рисунок 1 Рукоятка: Открутите стопорный болт (1), который находиться у подножья прибора, при помощи ключа с шестигранным углублением 5мм. Поверните наружу рукоятку на 90º. Вставьте стопорный болт в отверстие и снова закрутите его. Рисунок 1а 1. Общая информация. Автомобильные фары не должны не в коем случае ослеплять водителей встречных транспортных средств. Поэтому следует настроить наклон и азимут пучка световых лучей автомобильной фары в соответствии с действительными предписаниями.

4 Фирма NUSSBAUM поставляет контрольные приборы по настройке фар автомобиля для осуществления настроек автомобильных фар, предписанных законодательством Передвижное устройство по настройке автомобильных фар HLT 600 и HLT 610. Поверхность, на которой проводиться установка устройства по настройке автомобильных лобовых фар, должна быть ровной и не обязательно горизонтальной. Для того чтобы достичь предписанной точности измерения, неровности поверхности в области, где устанавливается устройство по настройке автомобильных фар, допускаются не более 1,2 мм. Рисунок 2 1. Зеркало выравнивания. 2. Рукоятка. 3. Люксметр. 4. Отклоняющее зеркало. 5. Обозначения для центра линзы.

5 1.2. Устройство для настройки фар автомобиля на наземных рельсах HLT 620. Занимающая площадь автомобилем и направляющие рельса устройства должны быть параллельны и горизонтальны по отношению друг к другу. Для достижения предписанной точности измерения, направляющие рельса на плоскости по отношению друг к другу не должны иметь наклон больше чем 1,3 мм. Рисунок 3 1. Вращающая ручка для центрирования контрольного прибора к продольной оси транспортного средства Устройство для настройки фар автомобиля. HLT 600, HLT 610 и HLT 620 соответствуют требованиям директивы Европейского сообщества 76/756 EWG, а также немецкому предписанию, которое было опубликовано в транспортном бюллетене, брошюра 16, страница 563, номер 134, параграф 50 «Правил допуска транспортных средств к движению». Рисунок 3а

6 2. Условия для настройки автомобильных фар Место проведения настройки Место проведения настройки должно соответствовать условиям, описанным под пунктом 1.1 и Давление воздуха в шинах. Все шины должны иметь давление воздуха, предписанное для данного транспортного средства Лобовые фары. Следует заменить дефектные линзы и зеркальные отражатели, а также потемневшие лампы накаливания, прежде чем проводить настройку лобовых фар. У лобовых фар, которые имеют регулирующие устройства, следует обратить внимание на следующее (Смотрите правила допуска транспортных средств к эксплуатации, брошюра 16/1987): Для настройки лобовых фар у автомобилей, у которых лобовые фары могут регулироваться вручную и с различными параметрами, регулирующее устройство должно находиться в предписанном фиксированном положении. При наличии лобовых фар с регулирующими устройствами только для 2 позиций, действуйте следующим образом: У транспортных средств, у которых световой пучок подымается при увеличении грузка автомобиля (погрузочное пространство — сзади), следует произвести настройку лобовых фар в конечном положении регулирующего устройства, при котором световой пучок будет находиться в самом высоком положении. У транспортных средств, у которых световой пучок опускается при увеличении груза автомобиля (погрузочное пространство — спереди), следует произвести настройку лобовых фар в конечном положении регулирующего устройства, при котором световой пучок будет находиться в самом низком положении 2.4 Установка контрольного прибора. Между прибором и лобовыми фарами должно быть такое расстояние, чтобы можно было провести настройку лобовых фар спереди автомобиля (приблизительно 30 см.). Центр линзы прибора может отклоняться не более чем на 3 см от лобовых фар. Данный центр отмечен соответствующими обозначениями на приборе (Смотрите рисунок 2, номер 5).

7 Для настройки высоты контрольного прибора следует ослабить тормозное приспособление, прокручивая вращающую ручку (1). Отпустив вращающую ручку, данное тормозное приспособление зафиксируется вновь само собой. Рисунок 4 1. Вращающая ручка для регулировки высоты контрольного прибора. 2. Вращающая ручка для настройки значения уклона. 2.5 Центрирование контрольного прибора по отношению к продольной оси транспортного средства Транспортное средство с плоским капотом двигателя. Зеркало выравнивания настраивается путем регулировки рукав зеркала (рисунок 2, номер 1) над головой к пользователю таким образом, чтобы в зеркале была видна передняя сторона транспортного средства с двумя внешними симметрическими ориентировочными точками (например: верхний край лобовых фар, стыковочная паласа капотного двигателя.). Контрольный прибор выравнивается в продольном направлении транспортного средства таким образом, чтобы линия визирования зеркала в равной степени касалась обеих внешних ориентировочных точек (Смотрите рисунок 5). У передвижных контрольных приборов (HLT 600 и 610) вышеуказанный процесс производиться путем передвижения прибора при помощи перевозной рукоятки. У контрольных приборов на наземных шинах (HLT 620) контрольный прибор поворачивается соразмерно при помощи вращающей ручки (Рисунок 3, пункт 1), которая находиться на опорном столбе. Рисунок 5

8 2.5.2 Автомобиль с кабиной над или перед двигателем. У автомобилей с вертикальной передней частью центры лобовых фар переносятся при помощи лота на землю (пол и т.д.) и на земле обозначаются мелом. Зеркало выравнивания следует нацелить на данные обозначения. Рисунок Настройка прибора. Установочное значение, который используется для лобовых фар, является показателем уклона в сантиметрах, который должен иметь границу Светло / Темно на расстоянии в 10 м. Для приборов Швейцарского исполнения шкала для измерения уклона дополнительно оборудована процентным показателем согласно ECR 48. Установочное значение приводиться в главе 3.1 и устанавливается до момента проверки при помощи вращающей ручки (рисунок 4, номер 2) прибора. Транспортное средство следует загрузить согласно инструкции. 3. Немецкие инструкции по настройке. Для согласования с директивой ЕС 76/765/ ЕЭС опубликована «Директива по настройке лобовых фар у грузовых транспортных средств» в транспортном бюллетене VkBI 1987, брошюра 16, страница 563. Значение сокращений: H = Высота центра лобовой фары над опорной поверхностью (см). e = Установочное значение в см, относительно уклона на расстоянии в 10 м. Указанное установочное значение преждевременно вводиться при помощи вращающей ручки прибора. (Смотрите пункт 2.6) N = Установочное значение в см, относительно расстояния а 5 м. Автомобили, у которых высшая точка святящего поля лобовых фар лежит не выше 140 см над опорной поверхностью. Введите установочное значение «е» при помощи вращающей ручки на контрольном приборе.

9 Вид транспортного средства Нагрузка Лобовые фары 1а Легковой автомобиль (Также: грузопассажирские автомобили) 1b Автомобиль, с подвеской, регулирующей уровень, или автоматическим выравниванием уклона светового пучка *. 1 с Многоосные тягачи или рабочие машины. 1d Одноколейное (безрельсовое) транспортное средство с двигателем ** 1e Грузовые автомобили с грузовой платформой, расположенной впереди. 1f Грузовые автомобили с грузовой платформой, расположенной сзади, за исключением транспортных средств пункта 1b. 1g Седельные тягачи, за исключением транспортных средств пункта 1b. 1h Автобусы, за исключением транспортных средств пункта 1b. 2 Автомобили, у которых высшая точка святящего поля лобовых фар лежит выше 140 см над опорной поверхностью. Один человек или 75 кг на месте водителя Следует принять во внимание указания изготовителя. Незагруженное транспортное средство согласно весу в порожнем состоянии, параграф 42, раздел 3 «Правил допуска транспортных средств к движению». Один человек или 75 кг на месте водителя. Незагруженное транспортное средство согласно весу в порожнем состоянии, параграф 42, раздел 3 «Правила допуска транспортных средств к движению». Незагруженное транспортное средство согласно весу в порожнем состоянии, параграф 42, раздел 3 «Правил допуска транспортных средств к движению». В соответствии с идентичными видами автомобилей 1 a-h, 2, H 3 Противо — туманные фары H +7 3

10 3 Одноосные тягачи или рабочие машины с постоянно включенными лобовыми фарами ближнего света, на которых указан необходимый уклон центра светового пучка. 4 Автомобили с разрешением согласно директиве 76/756 ЕЭС либо ЭКЕ R 48 Один человек или 75 кг на месте водителя. Незагруженное транспортное средство согласно весу в порожнем состоянии, параграф 42, раздел 3 «Правила допуска транспортных средств к движению». 2 х N 20 Указанное установочное значение на автомобиле. Также как в пунктах 1-3. * Следует принять во внимание характерные свойства данных устройств согласно инструкции изготовителя. ** Мопеды с осветительной установкой в 3 ватта следует рассматривать как велосипеды. 4. Фотограммы. Фотограммы можно рассматривать при помощи отклоняющего зеркала (Рисунок 10, номер 3) также с задней стороны контрольного прибора. Перед каждым измерением следует подготовить условия, приведенные под пунктом Лобовые фары с асимметрическим ближним светом. У лобовых фар для асимметрического ближнего света граница Светло / Темно ближнего света фар слева от центра должна касаться габаритной линии. Точка пересечения между левой (по возможности горизонтально) частью и справа восходящей частью границы Светло / Темно должна лежать по вертикали, которая проходит через центральную отметку. Для более легкого установления названной точки пересечения можно левую половину фары попеременно закрыть и снова открыть несколько раз. После того как была настроена граница Светло / Темно ближнего света фар в соответствии с инструкцией, середина светового пучка дальнего света у фар с общей регулировкой для ближнего и дальнего света должна лежать внутри предельных линий вокруг центральной отметки. У фар дальнего света, имеющих собственную регулировку, центр светового пучка должен лежать на центральной отметке Лобовые фары с симметричным ближним светом и противотуманные фары.

11 У лобовых фар для симметричного ближнего света и у противотуманных фар самая высокая часть границы Светло / Темно ближнего света должна касаться предельной линии и пробегать по возможности горизонтально через ширину контрольной поверхности. При боковом направлении данные лобовые фары должны быть настроены таким образом, чтобы распределение света лежало по возможности симметрично по отношению к вертикальной линии, которая проходит через центральную отметку. После того как была настроена граница Светло / Темно ближнего света фар в соответствии с инструкцией, середина светового пучка дальнего света у фар с общей регулировкой для ближнего и дальнего света должна лежать внутри предельных линий вокруг центральной отметки. (Смотрите рисунок 8) У фар дальнего света, имеющих собственную регулировку, центр светового пучка должен лежать на центральной отметке. (Смотрите рисунок 8) Пример: Линия раздела для границы Светло/ Темно у асимметричного ближнего света фар. Рисунок 7 Пример: Центральная отметка и ограничительные углы для середины дальнего света фар. Рисунок 8.

12 Пример: Линия раздела для границы Светло/Темно у симметричного ближнего света фар и противотуманных фар. Рисунок Лобовые фары с указанием уклона. У одноосных тягачей и рабочих машин с постоянно включенными фарами ближнего света, на которых указан уклон центра светового пучка, центр светового пучка должен находиться на линии раздела и на вертикальной линии, которая проходит через центральную отметку. 5. Люксметр. При помощи люксметра можно проверить силу исходящего от лобовых фар освещения после проведения настройки фар. Вращающая ручка настройки для введения установочного значения должна при этом находиться всегда на установочном значении 10 см/10 м. Ближний свет фар: Сила освещения должна оставаться ниже допустимого ослепляющего значения. Следует нажать на кнопку, которая расположена на люксметре. Стрелка должна оставаться внутри зеленой области на шкале, обозначенной буквой «А». Дальний свет фар: Сила освещения должна достигнуть минимального значения. Стрелка должна достигнуть зеленной области на шкале, обозначенной буквой «F». Рисунок Кнопка люксметра. 2. Шкала люксметра. 3. Поворотное зеркало

13 6. Техобслуживание и уход. Прибор для настройки лобовых фар представляет собой точный, оптический измерительный прибор. Для того чтобы сохранить точность измерительных функций прибора, следует избегать сотрясений данного прибора и грубого обращения с ним. Через определенные промежутки времени следует перепроверять точность показаний прибора. Это, в особенности, важно для мастерских, которые проводят работы согласно параграфу 29 «Правила допуска транспортных средств к движению». Для этого мы рекомендуем заключить договор технического обслуживания с компетентной сервисной службой Nussbaum. Перепроверка измерительных функций прибора будет проводиться специально для этого обученным персоналом при помощи соответствующих контрольных приборов в соответствии с заводскими предписаниями. В целях техобслуживания следует по случаю смазывать колеса несколькими каплями масла. Опорный столб следует сохранять в сухости и избегать попадания на него масла и жира! Линзы и зеркала следует их вытирать мягкой тряпкой.

Hierarchical imaging: a new concept for targeted imaging of large volumes from cells to tissues

Imaging large volumes such as entire cells or small model organisms at nanoscale resolution seemed an unrealistic, rather tedious task so far. Now, technical advances have lead to several electron microscopy (EM) large volume imaging techniques. One is array tomography, where ribbons of ultrathin serial sections are deposited on solid substrates like silicon wafers or glass coverslips.

Results

To ensure reliable retrieval of multiple ribbons from the boat of a diamond knife we introduce a substrate holder with 7 axes of translation or rotation specifically designed for that purpose. With this device we are able to deposit hundreds of sections in an ordered way in an area of 22 × 22 mm, the size of a coverslip. Imaging such arrays in a standard wide field fluorescence microscope produces reconstructions with 200 nm lateral resolution and 100 nm (the section thickness) resolution in z.

By hierarchical imaging cascades in the scanning electron microscope (SEM), using a new software platform, we can address volumes from single cells to complete organs. In our first example, a cell population isolated from zebrafish spleen, we characterize different cell types according to their organelle inventory by segmenting 3D reconstructions of complete cells imaged with nanoscale resolution. In addition, by screening large numbers of cells at decreased resolution we can define the percentage at which different cell types are present in our preparation. With the second example, the root tip of cress, we illustrate how combining information from intermediate resolution data with high resolution data from selected regions of interest can drastically reduce the amount of data that has to be recorded. By imaging only the interesting parts of a sample considerably less data need to be stored, handled and eventually analysed.

Conclusions

Our custom-designed substrate holder allows reproducible generation of section libraries, which can then be imaged in a hierarchical way. We demonstrate, that EM volume data at different levels of resolution can yield comprehensive information, including statistics, morphology and organization of cells and tissue. We predict, that hierarchical imaging will be a first step in tackling the big data issue inevitably connected with volume EM.

Background

In view of the recent success of super resolved fluorescence light microscopy or nanoscopy, as it is also called by one of the Nobel awardees [1], the question arises how relevant electron microscopy (EM) will be for the future of the life sciences. When it was introduced not quite 100 years ago it was not exactly a method suited to image entire cells or even complete model organisms at nanoscale resolution. However, new developments in volume EM [2, 3] are challenging that statement.

There are several ways to create volume EM data: The blockface methods, serial blockface scanning electron microscopy (SBFSEM: [4]) and focussed ion beam scanning electron microscopy (FIBSEM, reviewed in [5]), are well established in the field. Here the surface or blockface of a sample embedded in a resin block, is alternately imaged and removed in a cyclical manner in a SEM. Both methods are destructive, consuming the sample while it is being imaged. For SBFSEM this can lead to the necessity of imaging very large areas, in extreme cases the whole blockface, at rather high resolution, because it is not possible to rescan interesting areas later. In this way huge data sets (cf. [2]) are produced which may contain only few regions with really interesting events or substructures.

Another possibility to explore the third dimension with EM is the array tomography (AT) approach where arrays of ultrathin serial sections are deposited on large, solid substrates and imaged either in a light microscope (LM) or in a SEM. The method was originally introduced for multiplexing immuno-staining by repeated stripping and re-labelling of the section arrays in order to map synaptic connections in brain [6, 7]. In the neurosciences field, that pioneered all volume EM techniques (reviewed in [8]), variations of the original method are quite common, also extending it to SEM imaging (reviewed in [2, 9]). However, applications in cell and developmental or even general biology are rather scarce up to now [10–12]. One advantage of this method is its potential for hierarchical, targeted imaging, which we will illustrate with examples in the present paper. AT also allows correlative or conjugate [13] approaches, when substrates amenable to LM are used. To this end we developed a tool that helps to reliably create arrays of sections on a number of different substrates, suitable for SEM as well as for different modalities in LM.

Results

Custom-built substrate holder as prerequisite for reliable retrieval of multiple ribbons

The dominating problem when cutting serial sections is the successful retrieval of the sections from the knife boat in an ordered manner. To overcome this, the ATUMtome has been developed [14] which automatically collects thousands of serial sections on a plastic tape as individual, separate entities. The main disadvantage of this device is the fact, that the tape is not suitable for advanced light microscopy techniques, such as super resolution LM. In addition, contrary to connectomics, where indeed huge volumes need to be processed, questions in cell or developmental biology often ask for “only” several hundred sections. Having started to collect ribbons of sections manually onto solid substrates more or less successfully, we analysed all movements of the operator while doing this and came up with a new device (Fig. 1a, see also Additional file 1: Figure S1, Additional file 2: Figure S2, Additional file 3: Figure S3) allowing 7 degrees of free movement. The governing principle in the design of the substrate holder is the selection and arrangement of translation and rotation axes that on the one hand allow precise positioning and manipulation of the substrate (axes #4-#7) and on the other hand convenient adaptation and operation on different microtomes (axes #1-#3) and tables. Moreover besides adjustment of axes #1-#3, the holder can be reconfigured for operation on different microtome types and tables by changing the base holder support and the traverse. Depending on the type and supplier of the microtome the position where the knife is sitting on the microtome varies. Furthermore the distance of the knife to the front side of the table changes, depending on the position of the microtome on the table. Both parameters, the distance of the knife to the table front side and the height of the knife above the table top, may change when adapting the holder to a new lab situation. Apart from these, depending on the microtome type, the contour and the dimensions of the microtome main body have to be taken into account as well when fitting the substrate holder to the microtome. We change the traverse to adapt the offset between holder base and substrate clamp and the base holder support to adapt to knife height. Our holder has been adapted to, tested and used with a standard TMC vibration isolation table and after adaption of the base table fixation clamps with a custom-built Accurion table with integrated Halcyonics i4 active vibration isolation platform. Moreover we adapted to and applied it on two different ultra microtomes while developing our process (RMC Powertome, Leica UC7). In every single of these different configurations the substrate holder enabled the user to reliably deposit several long ribbons of serial sections onto one substrate (Fig. 1d, e). To be able to fit substrates up to the size of a conventional glass slide for LM into the knife boat, a Jumbo knife (Fig. 1b) has to be used. The actual substrate, e.g., a piece of silicon wafer (Fig. 1d) or a special glass coverslip (Fig. 1e) coated with indium tin oxide (ITO) is attached to a slide-sized supporter with a peelable adhesive and inserted into the knife boat (Fig. 1b and also Additional file 4: Movie S1). Ribbons of sections are directed away from the knife’s edge to the place where the water touches the substrate and attached to the dry part of the substrate that sticks out of the water (cf. Fig. 1c). Having collected a number of ribbons in that way, the substrate is smoothly lifted out of the water using the micropositioning stages (see also Additional file 5: Figure S4 for different lift-up trajectories). The movement can be controlled in such a way that even on substrates with rougher surfaces (e.g., ITO) no rupturing or other disturbance of the ribbons is observed. Besides standard ultrathin sections with a thickness ranging from 50 to 100 nm, ribbons consisting of semi-thin sections up to 1 μm thickness (Fig. 1f) have been handled.

Additional file 4: Movie S1 Substrate holder in action. (MP4 16804 kb)